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梯度膠電泳——蛋白條帶為何越跑越銳利
點擊次數： 更新時間：2024-04-30
還有兩個月就要迎來畢業季，各位準碩士、準博士們想必已經做完了實驗，正在整理數據，全力準備答辯，在這里預祝各位準畢業生們畢業順利。
做了多年WB實驗的同學們想必非常熟悉SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）了。在傳統的SDS-PAGE中，我們按傳統方式配制分層凝膠，先向膠板中灌入分層膠，待分層膠凝固之后再向其中加入濃縮膠，插上用于分隔上樣孔的梳子之后等待濃縮膠凝固之后便可以使用。凝固的聚丙烯酰胺形成了一張三維立體的網，網眼的疏密與凝膠的密度相關，濃度越高，網眼越密集，蛋白電泳的速度越慢。蛋白先從濃縮膠中經過，濃縮膠中的pH值較低，各種不同大小的蛋白以相近的速度泳動，并不斷堆疊壓縮，待條帶寬度被壓縮到合適的程度，再進入分離膠中，分離膠的pH值較高，SDS-蛋白復合物根據分子量的大小帶上均勻的負電荷，每單位分子量所受的電場力是相當的，因此在電泳中以分子量大小為基準分離成各個條帶，并基本保持了濃縮膠壓縮之后的形狀。
分層膠電泳原理示意
當我們使用分層膠進行電泳時，電壓通常不能過大，電泳的總產熱量正比于電壓的平方，而過熱會導致條帶的寬度變寬，與背景的對比度降低，進而降低條帶的分辨率。所以分層膠電泳通常是比較緩慢的，一般需要90分鐘或以上的時間。并且需要根據不同大小的蛋白使用各種不同濃度的聚丙烯酰胺凝膠。
那么我們有辦法在提高電壓加快電泳速度的同時還能夠使條帶壓縮得更好，分辨率更高嗎？使用梯度膠不失為一種好辦法。
垂直電泳中梯度膠是指從上到下聚丙烯酰胺濃度不斷增大的凝膠，常用的梯度膠濃度范圍為4~12%、4~15%、4~18%及4~20%。梯度膠可以將不同大小的蛋白均勻地分離開，4~20%的梯度膠可以覆蓋絕大多數常見的蛋白電泳分離需求，將不同大小的蛋白在不同濃度的區域進行分離。除了有利于廣分子量范圍的蛋白條帶分離，梯度膠還有一個重要的性質——蛋白條帶的自壓縮。
不知道各位讀者有沒有見過海浪，仔細觀察會發現海浪的形狀幾乎總是和海岸基線的形狀相同的，近岸的海浪總是平行于海岸的。
海岸邊一波波涌來的海浪
這是由于海浪作為有限振幅波，其運動速度與海水的深度相關，因為海水越淺，波的振動與傳播受到海底泥沙砂石等固體的影響，就會越慢。當海浪靠近海岸時，前排的海浪會受到越來越淺的海水的影響，移動速度逐漸降低，后續的海浪則會縮短與前排海浪的距離，直到它們的波前重疊在一起，此時海浪的波前線的形狀就與海水的等深線重合，也與海岸基線重合（因為通常離海岸基線越遠的海水越深）。
海浪由于越來越大的運行阻力而不斷重疊，與海岸基線保持平行的現象，和梯度膠中蛋白自壓縮的現象頗為相似。梯度膠中蛋白從上到下電泳，不斷從阻力較小的低濃度區域泳動至阻力較大的高濃度區域，并不斷被減速，此時相同大小的蛋白所形成的較寬的條帶中，靠后的蛋白處于濃度較低的區域中，泳動速度較快，而靠前的蛋白則位于濃度較高的區域中，泳動速度較慢，隨著電泳的持續進行，靠后的蛋白就會縮短與靠前的蛋白的距離，直到與其重疊，此時條帶的形狀與梯度膠的等濃度線重合，條帶也被壓縮到非常窄的區域內。
這便是梯度膠電泳中的蛋白條帶自壓縮現象。由于自壓縮所帶來的全程壓縮，梯度膠可以不用灌制濃縮膠（當然也可以結合濃縮膠和梯度膠來進一步提高壓縮效果），并全程使用200V或以上的高電壓進行電泳，電泳時間也可以縮短到50min左右，與此同時也能夠保持較好的條帶寬度、對比度，電泳條帶銳利清晰，提高蛋白條帶的分辨率。
在實驗室中手動灌制梯度膠是比較困難的，所以各位讀者可以選用中科通儀自動梯度制膠儀進行制作，一鍵灌裝，省心省力，助力您的科研事業。
中科通儀自動梯度制膠儀
4~18%梯度膠電泳效果示意圖
上文中通過海浪給各位讀者一個形象描述梯度膠自壓縮特性的方式，其實類似的現象在很多情況中都有發生，有時未必是好事，譬如在戰斗機以亞音速飛行的過程中，戰斗機機頭推動空氣在機身前方形成了一個空氣的高壓區，機身高速運動所發出的各種噪聲以密度波的形式以聲速向前方傳播，而高壓區中的當地聲速高于機頭高壓區更前方還未被擾動的空氣中的聲速，此時不斷因為速度更快而追上機頭高壓區的聲波便堆積形成了一堵以聲速運動、高溫高壓的空氣墻，也就是所謂的音障，這極大地阻礙了戰斗機的進一步提速，同時也會對機身的材料及結構剛性提出更高要求。
即將突破音障的超音速戰機
從亞音速飛行的戰斗機前方的音障，到平行于海岸傳播的海浪，再到梯度膠中自壓縮的蛋白條帶，物理學的原理無分大小，規制著整個物質世界的運行。
感謝各位讀者的閱讀，再次預祝各位準畢業生們順利畢業，前方一路坦途。
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